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本试剂盒基于Ni-IDA琼脂糖纯化树脂，包含优化的缓冲液，用于His标签融合蛋白的纯化。

Ni-IDA琼脂糖纯化树脂是以6%交联的琼脂糖为基质，通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸(IDA)并螯合镍离子(Ni²⁺)后的产品，可以纯化组氨酸标签的蛋白。含组氨酸标签的重组蛋白表达后，可以利用变性或非变性条件对目的蛋白进行纯化。

Ni-IDA树脂可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签蛋白的纯化。已经连接到树脂上的蛋白可以用低pH溶液、咪唑溶液洗脱。

• 非变性条件：
  Binding/Wash Buffer(含10mM咪唑)，货号：GS4633。
  Elution Buffer(含250mM咪唑)，货号：GS4634。
  
• 变性条件：
  Binding/Wash Buffer：20mM Tris-HCl，8M尿素，500mM NaCl，5mM咪唑，pH8.0。
  Elution Buffer：20mM Tris-HCl，8M尿素，500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0。

• 为了获得更多量和更高纯度的蛋白，需要确定最适咪唑浓度，不同蛋白是不同的。一般平衡缓冲液(Binding/Wash Buffer)20～40mM咪唑可适用于大部分蛋白但可能会降低蛋白与树脂的结合能力，洗脱缓冲液(Elution Buffer)500mM咪唑通常能将目的蛋白全部洗脱，建议初次洗脱进行咪唑梯度洗脱，以确定最适咪唑洗脱浓度，250mM咪唑为大部分蛋白的最适洗脱浓度。
  
• 在20mM咪唑存在下的蛋白上清液可以增加特异性，减少非特异性结合。但是如果在此浓度下标签蛋白不能和树脂结合，可以适当减少咪唑浓度到5～10mM或是在刚开始纯化时不加入咪唑。
  
• 所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤已减少杂质对填料的影响。

• 组氨酸标签蛋白样品准备(在大肠杆菌中非变性条件下可溶性表达)
  
  • 稀释：每克大肠杆菌菌体加入5～10mL Binding/Wash Buffer重悬，样品和Binding/Wash Buffer中含同样浓度的咪唑可以避免宿主细胞表达的蛋白质与暴露的组氨酸标签相结合。同时要去除大颗粒和高浓度的螯合剂，如EDTA，组氨酸、柠檬酸等杂质，防止破坏Ni-IDA树脂。
    
  • 酶解：加入0.2mg/mL溶菌酶，20μg/mL DNase，1mM MgCl₂，终浓度1mM PMSF或其他蛋白酶抑制剂，注意加入的抑制剂必须对镍柱没有影响，4℃振荡混匀30min。
    
  • 机械裂解：超声，均质，反复冻融等或其他类似技术。
    
  • 调整裂解液的pH至7.4，注意不要用强酸强酸调节pH(防止蛋白沉淀)。
    
  • 裂解液离心：将液体转移到离心管中在室温或4℃，12000rmp离心20min，温度的选择取决于蛋白的稳定性。
    
  • 收集上清准备进行后续实验，或是收集离心后的沉淀准备下一步实验。
    
  • 对于在酵母、昆虫及哺乳动物细胞系统中表达的蛋白，如果有大量体积的上清液可以用硫酸铵沉淀法进行蛋白浓缩，再用1X PBS透析换液后加入到柱中，如果样品中不含EDTA，组氨酸，柠檬酸等影响柱子的成分，可以直接上柱。
    
  • 如果在细胞质中表达蛋白质，可选用我司生产的(一步法昆虫活性蛋白提取试剂盒，一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒，一步法酵母活性蛋白提取试剂盒)试剂盒或参考相关文献。将提取的蛋白与5倍量的Binding/Wash Buffer混合制备样品，其它配方的Binding/Wash Buffer可以根据经验确定。
    
    • 可以将样品直接上柱(省略以上步骤)。如果直接上柱，延长机械裂解时间，例如超声10min。样品粘度越高纯化所需的总时间越长。
• 组氨酸标签蛋白样品准备(在大肠杆菌中包含体表达变性条件纯化)
  
  • 用1×PBS悬浮细胞(每mL细菌沉淀需要约5mL的1×PBS)，按照上面的超声条件进行实验。
    
  • 裂解液在12000rpm离心10min收集包涵体。用1×PBS洗涤几次包涵体。
    
  • 将变性条件下加入含有变性剂的Binding/Wash Buffer(每mL包涵体需要约5mL的Binding/Wash Buffer)，并在室温下孵育30～60min，可能需要均质或超声将沉淀完全溶解。
    
  • 12000rpm离心30min去除剩余的不溶物，小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀。

• 离心法组氨酸标签蛋白纯化步骤(适用于GS4384产品孵育操作)
  可根据自身实验情况进行调整，可以在室温或是4℃进行纯化。
  
  • 加入适量的Ni-IDA树脂到离心管中。离心管在3000rpm离心2min然后小心的去除上清(保持低速离心，以免损坏柱料)。
    
  • 加入两倍柱体积的Binding/Wash Buffer将缓冲液和树脂完全混匀平衡柱料。
    
  • 再将离心管在3000rpm离心2min然后小心去除上清。
    
  • 将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer 1:1混匀或直接上柱，使混合液总体积相当于两倍树脂体积。
    
  • 将上步中的样品混合液加入树脂中，再旋转振荡混匀30min，使混合液与树脂充分混匀。
    
  • 将离心管在3000rpm离心2min，吸出上清，如需要可将上清留存进行下游分析。
    
  • 用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer清洗，再将离心管在3000rpm离心2min吸出上清，如需要可将上清留存进行下游分析。
    
  • 重复清洗步骤，通过测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值。
    
  • 用一倍树脂体积的Elution Buffer洗脱树脂上的组氨酸标签蛋白，将离心管在3000rpm离心2min，然后小心的吸出并保存上清。此步骤重复两次，将每次的洗脱液分别保存。
    
  • 通过测量在280nm处吸光度或用我司产的改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(GS1482)或BCA法蛋白浓度测定试剂盒(GS1480)确定洗脱液中蛋白浓度，洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。
• 重力法组氨酸标签蛋白纯化步骤(如选购GS4384产品需要进行额外装柱处理)
  可根据自身实验情况进行调整，可以在室温或是4℃进行纯化。
  
  • 根据需求载量取一根相应规格Ni-IDA预装柱，将存储缓冲液通过重力流出。
    
  • 用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，使用0.5～1mL/min流速，使Buffer缓慢排出树脂。
    
  • 将蛋白提取物与Binding/Wash Buffer 1:1混匀制备样品液，使样品液的总体积是柱体积的两倍。
    
  • 将样品液加入柱子上，收集流穿液到离心管中。如有多余样品可再次上样，重新流通一次可提高样品与填料的结合力。
    
  • 用两倍柱体积的Binding/Wash Buffer清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复这个步骤，直到流穿液在280nm处吸光度接近基线。
    
  • 用两倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，此步骤重复2次，每次的洗脱液分别储存，直到洗脱液在280nm处吸光度接近基线。
    
  • 柱料后处理：用5倍体积Elution Buffer洗脱柱料，再用5倍体积Binding/Wash Buffer平衡柱料，最后用5倍体积ddH2O清洗柱料，加入20%乙醇保护液，置于2～8℃保存，不可冻存。
    
  • 通过测量在280nm处吸光度或用我司产的改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒(货号：GS1482)或BCA蛋白定量检测试剂盒(货号：GS1480)确定洗脱液中蛋白浓度，洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。

• 可用凝胶过滤的方法(重力型去盐柱(货号：GS1466))或透析法去除咪唑，如进行SDS-PAGE，样品中含6M盐酸胍时必须透析到8M尿素中。
  
• 如想得到更好的纯化效果，请适当延长样品与树脂结合的孵育时间。
  
• 以上柱体积特指柱料体积。
  
• 填料反复使用建议用于同种蛋白的纯化，以防污染。

• 用15倍柱体积的0.5M的NaOH清洗树脂，最好在30min内清洗完毕并适当调整流量(如用0.5M的NaOH清洗1mL Ni-IDA树脂，流速为0.5mL/min，总体积为15mL)。
  
• 用10倍柱体积的1×PBS重新平衡，平衡好的树脂可进行纯化实验或用20%的乙醇储存留用。

• 若需长时间在位清洗或处理大量树脂时建议先将Ni2+脱掉(可参照再生步骤)，再进行在位清洗步骤，清洗完成后再挂Ni2+，保
  
• 存到20%的乙醇中。

• 用10倍柱体积的Stripping Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，100mM EDTA，pH8.0)进行清洗。
  
• 用10～20倍柱体积去离子水清洗树脂。
  
• 用5倍柱体积的100mM NiSO4(溶解于去离子水中)洗涤树脂。
  
• 用10倍柱体积的1X PBS重新平衡，平衡好的树脂可进行纯化实验或用20%的乙醇储存留用。